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REVISTA NORTE MINEIRA DE ENFERMAGEM
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INTRODUÇÃO
A
cicatrização de feridas é um processo complexo que envolve a organização de
células, sinais químicos e remodelamento da matriz extracelular, com o objetivo
de reparar o tecido(1). Todavia,
vários fatores podem interferir esse processo, alguns sendo locais como a
oxigenação e a infecção e outros de origem sistêmica, estando diretamente
ligados ao estado geral do indivíduo, como por exemplo, a idade e possíveis comorbidades como diabetes e hipertensão, além da nutrição(2).
Assim,
no indivíduo diabético o processo de reparação tecidual é comprometido,
principalmente em decorrência da perfusão sanguínea inadequada mais prevalente
em feridas crônicas. Essa má perfusão ocasiona o excesso de radicais livres
gerados, principalmente as espécies reativas de oxigênio (ROS), levando ao
estresse oxidativo. Os níveis reduzidos de
antioxidantes, geralmente, são acompanhados por níveis elevados de marcadores
de estresse oxidativo, que desempenham um papel vital
em retardar a cicatrização de feridas(3-4).
Radicais
livres são comumente formados no corpo humano, sendo resultado de vários
processos, como no metabolismo aeróbico ou pela ação dos sistemas enzimáticos
como as catalases, oxido nítrico e as NAD(P)H
oxidases. São substâncias que em pequenas concentrações, desempenham funções
fisiológicas importantes, sendo estas a sinalização intra
e intercelular e produção de hormônios(5-6).
Quando
há uma produção aumentada dos radicais livres, o organismo utiliza de sistemas
de defesa antioxidantes, que são compostos que atuam inibindo ou diminuindo os
efeitos do estresse oxidativo gerados pelos radicais
livres e compostos oxidantes, sendo classificados em sistema de defesa
antioxidante enzimático, composto pelas enzimas produzidas no organismo e o
sistema de defesa antioxidante não enzimático, fazendo parte deste grupo as
vitaminas e outras substâncias, como os flavonoides, licopeno e bilirrubina.
São de extrema importância, pois minimizam os danos ao DNA e as macromoléculas(5-7).
Nessa perspectiva, o ácido lipóico (ALA) apresenta-se como um potente agente
antioxidante, atuando por diversas vias ou mecanismos, proporcionando efeitos antinflamatórios, antitrombóticos, além de efeitos
metabólicos e endoteliais(8-9). Sua propriedade antioxidante se dá
através da sua capacidade de sequestrar espécies reativas de oxigênio (ROS), da
sua capacidade de regenerar antioxidantes endógenos e também por sua atividade
metal quelante, que resulta na diminuição das ROS(10).
O ALA
é um ácido graxo de oito carbonos contendo um anel tiolano
com uma ponte dissulfeto entre os carbonos 6 e 8.
A capacidade de ser um potente antioxidante é possível graças ao
grupamento tiol presente em sua estrutura que reage de forma direta com os
agentes oxidantes, e por conta disto, o mesmo pode ser considerado um agente
terapêutico eficaz contra vários tipos de patologias onde o dano oxidativo é implicado(11).
Nesse sentido, o comprometimento da
cicatrização de feridas e a busca por métodos adequados de tratamento, são
grandes desafios para o profissional de enfermagem que cuida de feridas em
indivíduos com diabetes. Considerando o papel dos radicais livres no
comprometimento da cicatrização de feridas, e a busca por terapias
antioxidantes para prevenção e tratamento de lesões celulares promovidas pelo
estresse oxidativo, se faz necessário um estudo
direto sobre esse produto, a fim de contribuir para um melhor tratamento dessas
lesões.
Para tal estudo, o modelo experimental de
Diabetes Mellitus induzido por aloxano foi utilizado,
visto que o mesmo é amplamente evidenciado na literatura(12-13), por
tratar-se de um agente citotóxico para as células β secretoras de insulina do
pâncreas(14), sendo que o mesmo ainda induz sinais clínicos
semelhantes aos encontrados na síndrome diabética em humanos(15). Face
ao exposto, o objetivo deste estudo foi averiguar os efeitos antioxidantes do
ácido lipóico no tratamento de lesões cutâneas no
modelo experimental de Diabetes mellitus induzido pelo aloxano
em ratos.
método
Animais
Os experimentos foram
realizados no Laboratório de Tecnologias e Inovações Farmacológicas - LATIF
(CNPq/URCA) da Universidade Regional do Cariri - URCA em ratos machos Wistar albinos pesando entre 200-300 gramas. Os animais são
provenientes do biotério universidade regional do cariri. Os animais foram
mantidos em temperatura controlada (23 ± 1°c), com ciclo claro/escuro de 12h e
livre acesso a água e alimentos. Todos os procedimentos experimentais foram
realizados de acordo com o Comitê de Ética em Uso de Animais (CEUA) da
Universidade Regional do Cariri, sob o parecer do nº. 00167 / 2018.1.
Indução
de diabetes experimental
Para indução do
diabetes, os animais foram submetidos a jejum por 24 horas e após esse período
foram anestesiados com xilazina 10mg / kg e cetamina 100mg / kg para administração de aloxano na dose de 50mg / kg pela veia peniana dorsal. Seis
horas após a injeção de aloxano, foi disponibilizado
solução de glicose (10%) por um período de 24 horas. Para verificar o diabetes,
a glicemia foi verificada 72 horas após a administração do aloxano
e no dia da eutanásia. Os animais que não apresentaram valores iguais ou
superiores a 250 miligramas de glicose por decilitro de sangue foram
descartados. As verificações foram feitas retirando sangue da ponta da cauda do
animal anestesiado e largando-o nas fitas de reagentes accu-chek
active® e depois lendo-o em um aparelho accu-chek active®.
Tricotomia
e produção da ferida cutânea
Confirmado o diabetes
e após a anestesia, os animais foram mantidos em decúbito dorsal, foi realizada
tricotomia manual das costas, seguida de antissepsia do campo operatório com povidine-iodine e, posteriormente, excisão cirúrgica de um
fragmento de pele, medindo cerca de 7 mm em seu comprimento total, com o
auxílio de um punch,
padronizando desta forma a ferida e tomando-se o cuidado para que todas as
camadas fossem removidas, restando apenas a musculatura subjacente. Após a
cirurgia, os animais foram alojados em gaiolas limpas, 5 indivíduos por gaiola.
Protocolo
de tratamento
Após a cirurgia, os
animais foram divididos em três grupos, contendo cinco animais, para receberem por
via oral água destilada (controle) ou ALA (100mg / kg ou 200mg / kg) por 1, 7
ou 14 dias (fig. 1).
Figura 1- Protocolo
de tratamento com salina (Controle), ácido lipóico
100 mg/kg (ALA 100) ou ácido lipóico 200 mg/kg (ALA
200).
Análise
do efeito antioxidante
Foram analisados os
seguintes parâmetros: mensuração da peroxidação lipídica a partir das amostras do homogenato dos tecidos obtidos da pele dos animais, assim as
amostras foram adicionadas a um sistema catalisador de formação de radicais
livres (FeSO4 0,01 mM e ácido ascórbico 0,1 mM), e então mantidas a 37ºC por 30 min. A reação foi
interrompida pela adição de ácido tricloroacético 10%, posteriormente as
amostras foram centrifugadas (3000 rpm/15 min), sendo o sobrenadante retirado e
acrescido de ácido tiobarbitúrico 0,8%, sendo colocado depois em banho-maria
por 15 minutos. Após resfriamento, foi medida a absorbância em 535nm. A peroxidação lipídica foi expressa em µmol de malonildialdeído /mg de tecido.
Determinação de
Nitrito/Nitrato, a concentração de
nitrito foi determinada na pele do rato homogeneizada imediatamente após a
dissecação de todos os grupos. Após centrifugação (800×g/10 min), o
sobrenadante do homogeneizado foi coletado e a produção de Óxido Nítrico (NO) foi determinada
com base na reação Griess16. Para tanto, 100µL do sobrenadante foi
incubado com 100µL do reagente de Griess (sulfanilamine em 1% H3PO4/0.1% N-(1-naftil) etilenodiamina-dicloridrato / 1% H3PO4 / água destilada, 1:1:1:1) em
temperatura ambiente por 10 min. A absorbância foi
medida em leitor de
microplaca a 550nm. A curva padrão foi preparada com várias concentrações de
NaNO2 (variando de 0,75-100 µM) e os resultados foram expressos em µmol / g de
proteína.
Para a determinação
da concentração do GSH, homogenatos 10% (w / v) em
EDTA 0,02 M foram adicionados a uma solução de ácido tricloroacético a 50%.
Depois de centrifugação (de 3000 r / min durante 15 min), o sobrenadante de
homogeneizado foi recolhido e a concentração de produção de GSH foi determinada17.
Resumidamente, as amostras foram misturadas com tampão de 0.4 M Tris-HCl, pH 8,9 e 0,01 M de DTNB. Nível GSH foi determinada
pela absorvância a 412 nm e
foi expressa como ng/g de tecido húmido de GSH.
Análise
Estatística
Todas as análises
foram realizadas por meio da análise de variância (ANOVA), usando o software Prism 8.0.2 versão para Windows, GraphPad Software (San Diego, CA, EUA). Para avaliação da
significância, comparações múltiplas foram feitas com ANOVA e por Tukey como post hoc testes. Os resultados foram
considerados significativos para p <0,05 e apresentados como média ± EPM.
RESULTADOS
Mensuração da Peroxidação Lipídica
A figura 2 mostra os efeitos da
administração aguda (fig. 2A), em doses repetidas por 7 (fig. 2B) ou 14 (fig.
2C) dias do ALA sobre a concentração de malonildialdeído em lesões de ratos diabéticos
induzidos pelo aloxano.
Assim, o
tratamento agudo com a menor dose de ácido lipóico
(ALA 100: 3,0±0,5) reduziu significativamente a concentração de MDA quando
comparada ao grupo controle (8,3±0,8) (fig. 2A). Na administração em doses
repetidas por 7dias, observou-se que a maior dose de ácido lipóico
(ALA 200: 16,1±2,6) reduziu significativamente a concentração de MDA quando
comparada ao grupo controle (44,4±7,9) (fig. 2B). Resultado semelhante
evidenciou-se com o tratamento em doses repetidas por 14 dias onde a maior dose
de ácido lipóico (ALA 200: 36,80±4,9) reduziu
significativamente a concentração de MDA quando comparada ao grupo controle
(95,0±15,3) (fig. 2C).
Figure 2- Efeitos do ácido lipóico
sobre a contração de malonildialdeído sobre as lesões
em ratos diabéticos induzidos pelo aloxano. Cada
barra representa média ± EPM. (A) Animais tratados por 1 dia com veículo
(controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100) ou
ácido lipóico 200 mg/kg (ALA 200), (B) Animais
tratados em doses repetidas por 7 dias com veículo (controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100) ou ácido lipóico
200 mg/kg (ALA 200) e (C) Animais tratados em doses repetidas por 14 dias com
veículo (controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100)
ou ácido lipóico 200 mg/kg (ALA 200). Para todas as
análises, p < 0,05 foi considerado significativo (ANOVA seguida de Tukey como teste post-hoc).
Determinação de
Nitrito/Nitrato
Desta forma,
administrações agudas por gavagem com a menor dose de
ácido lipóico (ALA 100: 3,7±0,5) reduziu
significativamente a concentração de nitrito/nitrato quando comparada ao grupo
controle (6,5±0,4) (fig. 3A). O tratamento em doses repetidas por 7 dias
apontou que todas as doses do ácido lipóico estudadas
(ALA 100: 3,5±0,2; ALA 200: 2,7± 0,4) reduziram significativamente a concentração de
nitrito/nitrato quando comparada ao grupo controle (5,6±0,6) (fig. 3B). As
doses repetidas de ácido lipóico por 14 dias (ALA
100: 1,9± 0,3; ALA 200: 1,8±0,3) diminuíram
expressivamente a concentração de nitrito/nitrato quando comparada ao grupo
controle (5,0±0,3) (fig. 3C).
Figure 3- Efeitos do ácido lipóico
sobre a contração de Nitrito/Nitrato sobre as lesões em ratos diabéticos
induzidos pelo aloxano. Cada barra representa média ±
EPM. (A) Animais tratados por 1 dia com veículo (controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100) ou ácido lipóico
200 mg/kg (ALA 200), (B) Animais tratados em doses repetidas por 7 dias com
veículo (controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100)
ou ácido lipóico 200 mg/kg (ALA 200) e (C) Animais
tratados em doses repetidas por 14 dias com veículo (controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100) ou ácido lipóico
200 mg/kg (ALA 200). Para todas as análises, p < 0,05 foi considerado
significativo (ANOVA seguida de Tukey como teste
post-hoc).
Determinação da
concentração do GSH
A figura 4 mostra os efeitos da administração aguda (fig. 4A), em
doses repetidas por 7 (fig. 4B) ou 14 (fig. 4C) dias do ácido lipóico sobre a concentração de GSH em lesões de ratos
diabéticos induzidos pelo aloxano.
A administração por um dia de ácido lipóico
(ALA 100: 7504,0±582,5; ALA 200: 7535,0±234,6) elevou significativamente a
concentração de GSH quando comparada ao grupo controle (5673,0±129,9) (fig.
4A). Evidenciou-se resultado similar no tratamento em doses repetidas por 7dias
com ácido lipóico (ALA 100: 646,1±72,6; AL 200: 670,2±101,2)
quando comparada ao grupo controle (333,5±25,83) (fig. 4B), assim como as doses
repetidas de ácido lipóico por 14 dias (ALA 100:
4939,0±364,7; ALA 200: 4972,0±207,7) em relação ao grupo controle (767,9±208,4)
(fig. 4C).
Figure 4 - Efeitos do ácido lipóico
sobre a concentração de GSH sobre as lesões em ratos diabéticos induzidos pelo aloxano. Cada barra representa média ± EPM. (A) Animais
tratados por 1 dia com veículo (controle), ácido lipóico
100 mg/kg (ALA 100) ou ácido lipóico 200 mg/kg (AL
200), (B) Animais tratados em doses repetidas por 7 dias com veículo
(controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100) ou
ácido lipóico 200 mg/kg (ALA 200) e (C) Animais
tratados em doses repetidas por 14 dias com veículo (controle), ácido lipóico 100 mg/kg (ALA 100) ou ácido lipóico
200 mg/kg (ALA 200). Para todas as análises, p < 0,05 foi considerado
significativo (ANOVA seguida de Tukey como teste
post-hoc).
DISCUSSÃO
De acordo com as Diretrizes da Sociedade Brasileira de Diabetes, o
DM é um grupo heterogêneo de distúrbios metabólicos que apresenta em comum à
hiperglicemia resultante de defeitos na ação da insulina, na secreção de
insulina ou em ambas(18). Sendo
assim a dificuldade de cicatrização de feridas em diabéticos tem etiologia
multifatorial e o processo é delongado por fatores como inflamação crônica,
defeitos na função dos fibroblastos e da angiogênese,
falha na migração celular, e associado a isso tem a isquemia de membros
inferiores, sendo um fator crítico na resistência da cicatrização(19).
MDA
é um produto da peroxidação lipídica das membranas
celulares formado após ataque de radicais livres. A peroxidação
lipídica ocorre quando os radicais hidroxila atacam cadeias laterais de ácido
graxos de fosfolipídios de membrana(20)
O TBARS, é indicado pela concentração de MDA, serve como um índice de dano oxidativo das membranas celulares(21). Em um
estudo, foi relatado que os níveis séricos e da pele de MDA nos grupos de ALA e
de L-carnosina foram menores do que aqueles do grupo
controle (P <0,05)(22), o que
está de acordo com os resultados desta investigação. Neste estudo, o ALA
reduziu significativamente os níveis de peróxido nas lesões
de ratos diabéticos (P <0,05).
O
óxido nítrico é um gás sintetizado a partir de L-arginina, numa reação catalisada
pela enzima óxido nítrico sintase (NOS). Este gás
desempenha um papel importante em processos fisiológicos, no entanto, na
presença de ânion superóxido, o óxido nítrico é convertido num radical livre
potente: peroxinitrito, que é um agente extremamente
nocivo para as células(23). Em
uma pesquisa desenhada para investigar o papel radioprotetor
do ALA, um antioxidante em fibroblastos da pele de murinos
expostos a uma dose única de 2, 4, 6, ou 8GY γ-radiação, apontou uma
correspondência significativa entre a concentração de NO e dose de radiação.
Por exemplo, 2 Gy fibroblastos irradiados teve 3,81 ±
0,28 uM nitrito / mg de proteína celular enquanto 8GY
tinha 7,98 ± 0,47 uM nitrito / mg de proteína
celular. E após o tratamento com ALA reduziu significativamente a produção de
NO em fibroblastos irradiados.
De
modo similar aos resultados supracitados, o presente estudo demonstrou uma
correlação positiva entre a administração de ALA
agudo ou em doses repetidas e a redução da concentração de nitrito/nitrato.
A
glutationa (GSH, l-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina) é o mais abundante antioxidante
intracelular presente em todos os organismos vivos. Este tripeptídeo
de baixo peso molecular é caracterizado por um grupo reativo tiol ligado ao γ-glutamil que é um agente de captação natural na
desintoxicação de radicais livres, bem como eletrófilos
reativos. GSH é predominantemente um antioxidante intramitocondrial,
e sua diminuição enfraquece a defesa antioxidante mitocondrial e se deteriora a
função mitocondrial(24). Em
geral, a diminuição na concentração de GSH celular pode ser considerada como um
evento precoce na cascata apoptótica que pode levar à
morte celular.
Acerca
do GSH, em estudo anterior, não houve diferenças significativas na atividade da
GSH-Px no soro, pele ou fígado após a suplementação
de ALA quando comparado ao grupo controle, o que pode ser devido aos baixos
níveis de ALA na suplementação (12 - 14 mg / dia)(22).
Entretanto, outro estudo demonstrou que a depleção de GSH em células PC12
dopaminérgicas afeta a integridade mitocondrial e que o pré-tratamento
de células PC12 com ácido lipóico atua para impedir o
esgotamento de conteúdo de GSH e preserva a atividade mitocondrial, que
normalmente é prejudicada, como consequência da perda de GSH(25).
Em analogia, os achados do presente estudo apresentaram uma semelhança a
investigação anteriormente exposta ao apontarem que a
administração de ácido lipóico agudo ou em doses
repetidas elevou a concentração de GSH.
Por
fim, foi verificado que o ALA apresentou um efeito protetor para o estresse oxidativo presente nas lesões de pele em ratos com diabetes
mellitus induzido pelo aloxano.
Conclusão
Mediante
análise dos resultados, pode-se inferir que este estudo possibilitou averiguar os efeitos antioxidantes do ALA no tratamento de
lesões cutâneas no modelo experimental de Diabetes mellitus induzido pelo aloxano em ratos, uma vez que o ALA reduziu a concentração
de MDA, de nitrito/nitrato e elevou a concentração de GSH no tratamento aguda,
em doses repetidas por 7 ou 14 dias.
Face ao exposto conclui-se, ser o ALA um agente sistêmico dermoprotetor e com potencial terapêutico para o tratamento
das alterações promovidas pelo aloxano nos parâmetros
de MDA, de nitrito/nitrato e GSH em lesões de ratos. Assim, os achados desta
presente investigação nos possibilitam subsídios para continuação dos estudos
com o ALA e desta forma avaliar os efeitos dermoquímicos
desta substância por via tópica.
Os autores
declaram não haver conflitos de interesse.
AGRADECIMENTOS
Este trabalho teve suporte
financeiro da Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e
Tecnológico (FUNCAP) (4088623/2018).
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